US 10,865,441 C1 (12,985th)
Mutant taq polymerase for faster amplification
Zhenyu Zhu, Lynnfield, MA (US); and Dapeng Sun, Lexington, MA (US)
Filed by AbClonal Science, Inc., Woburn, MA (US)
Assigned to ABCLONAL SCIENCE, INC., Woburn, MA (US)
Reexamination Request No. 90/019,548, Jun. 25, 2024.
Reexamination Certificate for Patent 10,865,441, issued Dec. 15, 2020, Appl. No. 16/813,425, Mar. 9, 2020.
Claims priority of provisional application 62/818,011, filed on Mar. 13, 2019.
Ex Parte Reexamination Certificate issued on Jul. 15, 2025.
Int. Cl. C12N 9/52 (2006.01); C12N 9/12 (2006.01); C12N 15/63 (2006.01); C12Q 1/686 (2018.01)
CPC C12Q 1/686 (2013.01) [C12N 9/12 (2013.01); C12N 15/63 (2013.01); C12Q 2521/10 (2013.01); C12Q 2527/101 (2013.01); C12Q 2533/101 (2013.01)]
AS A RESULT OF REEXAMINATION, IT HAS BEEN DETERMINED THAT:
Claims 4-5 are cancelled.
Claims 1, 2 and 16 are determined to be patentable as amended.
Claims 7-12, 14, 15 and 17-20, dependent on an amended claim, are determined to be patentable.
Claims 3, 6, 13 and 21-26 were not reexamined.
1. A mutant Taq polymerase comprising: one or more of the following amino acid mutations shown in the following even-numbered sequences, and wherein the remainder of the mutant polymerase has at least 80% [ 99.6% ] amino acid sequence identity with wild type Taq polymerase, as shown in SEQ ID NO: 4 but wherein wild type Tag polymerase does not include the 6-membered histidine tag at its C-terminus and the six immediately preceding Glycine and Serine amino acids shown in SEQ ID NO: 4:
G32P (SEQ ID NOS: 402-403),
T34I (SEQ ID NOS: 408-409),
E39K/E230K (SEQ ID NOS: 28-29), E39K/D320R (SEQ ID NOS: 30-31), E39K/E507K (SEQ ID NOS: 32-33), E39K/E520K (SEQ ID NOS: 34-35), E39K/E537K (SEQ ID NOS: 36-37), E39K/D578R (SEQ ID NOS: 38-39), E39K/D732R (SEQ ID NOS: 40-41), E39K/B742K (SEQ ID NOS: 42-43), E39K/E189K (SEQ ID NOS: 44-45),
Q42R (SEQ ID NOS:
406-407),
E101K (SEQ ID NOS: 46-47),
V103S (SEQ ID NOS: 410-411),
Y116A (SEQ ID NOS: 412-413),
E117K (SEQ ID NOS: 48-49),
E130K (SEQ ID NOS: 50-51),
D144R (SEQ ID NOS: 6-7),
E159K (SEQ ID NOS: 56-57),
I163S (SEQ ID NOS: 404-405),
E189C (SEQ ID NOS: 58-59), E189D (SEQ ID NOS: 60-61), E189K/E507K (SEQ ID NOS: 66-67), E189K/E537K (SEQ ID NOS: 68-69), E189K/D578R (SEQ ID NOS: 70-71), E189K/D732R (SEQ ID NOS: 72-73), E189K/E742K (SEQ ID NOS: 74-75),
E189K/E230K/E537K (SEQ ID NOS: 76-77), E189K/E507K/B537K (SEQ ID NOS: 78-79), E189K/E520K/E537K (SEQ ID NOS: 80-81), E189K/E230K/E520K (SEQ ID NOS: 84-85), E189K/E230K/D578R (SEQ ID NOS: 86-87), E189K/B507K/D578R (SEQ ID NOS: 88-89), E189K/E230K/D732R (SEQ ID NOS: 90-91), E189K/E537K/D732R (SEQ ID NOS: 92-93), E189K/E507K/ES520K (SEQ ID NOS: 94-95), E189K/E537K/D578R (SEQ ID NOS: 96-97), E189K/B537K/E742K (SEQ ID NOS: 98-99), E189K/D732R/E742K (SEQ ID NOS: 100-101),
E189L (SEQ ID NOS: 102-103), E189M (SEQ ID NOS: 104-105), E189P (SEQ ID NOS: 106-107), E189Q (SEQ ID NOS: 108-109), E189R (SEQ ID NOS: 110-111), E189T (SEQ ID NOS: 112-113), E189W (SEQ ID NOS: 114-115),
E201K (SEQ ID NOS: 116-117),
E230C (SEQ ID NOS: 122-123), E230F (SEQ ID NOS: 124-125), E230H (SEQ ID NOS: 126-127),
E230K/E520K (SEQ ID NOS: 132-133), E230K/E537K (SEQ ID NOS: 134-135), E230K/D578R (SEQ ID NOS: 136-137), E230K/D732R (SEQ ID NOS: 138-139), E230K/E742K (SEQ ID NOS: 140-141),
E230K/B507K/E520K (SEQ ID NOS: 142-143), E230K/E507K/E537K (SEQ ID NOS: 144-145), E230K/E520K/D578R (SEQ ID NOS: 146-147), E230K/E537K/D578R (SEQ ID NOS: 148-149), E230K/E537K/D732R (SEQ ID NOS: 150-151), E230K/E507K/E742K (SEQ ID NOS: 152-153), E230K/E520K/E742K (SEQ ID NOS: 154-155), E230K/E537K/E742K (SEQ ID NOS: 156-157), E230K/D578R/E742K (SEQ ID NOS: 158-159), E230K/D732R/E742K (SEQ ID NOS: 160-161),
E230M (SEQ ID NOS: 162-163), E230N (SEQ ID NOS: 164-165), E230P (SEQ ID NOS: 166-167), E230Q (SEQ ID NOS: 168-169), E230R (SEQ ID NOS: 170-171), E230S (SEQ ID NOS: 172-173), E230T (SEQ ID NOS: 174-175), E230V (SEQ ID NOS: 176-177), E230W (SEQ ID NOS: 178-179), E230Y (SEQ ID NOS: 180-181),
D320R (SEQ ID NOS: 184-185),
L322S (SEQ ID NOS: 186-187),
A323F (SEQ ID NOS: 188-189),
R328D (SEQ ID NOS: 190-191),
G330P (SEQ ID NOS: 192-193),
R334D (SEQ ID NOS: 194-195),
P336G (SEQ ID NOS: 196-197),
E337K (SEQ ID NOS: 198-199),
P338G (SEQ ID NOS: 200-201),
Y339A (SEQ ID NOS: 202-203),
D344R (SEQ ID NOS: 204-205),
E347K (SEQ ID NOS: 206-207),
A348F (SEQ ID NOS: 208-209),
R349D (SEQ ID NOS: 210-211),
L351S (SEQ ID NOS: 212-213),
L361S (SEQ ID NOS: 214-215),
L365S (SEQ ID NOS: 216-217),
G366P (SEQ ID NOS: 218-219),
P368G (SEQ ID NOS: 220-221),
M374S (SEQ ID NOS: 222-223),
L380S (SEQ ID NOS: 224-225),
D381R (SEQ ID NOS: 226-227),
P382G (SEQ ID NOS: 228-229),
S383I (SEQ ID NOS: 230-231),
N384R (SEQ ID NOS: 232-233),
A391F (SEQ ID NOS: 234-235),
A407F (SEQ ID NOS: 240-241),
A414F (SEQ ID NOS: 242-243),
[E507Q (SEQ ID NOS: 270-271),] E507R (SEQ ID NOS: 272-273), E507S (SEQ ID NOS: 274-275), E507T (SEQ ID NOS: 276-277), E507Y (SEQ ID NOS: 278-279),
E507K/E520K (SEQ ID NOS: 246-247), E507K/E537K (SEQ ID NOS: 248-249), E507K/D578R (SEQ ID NOS: 250-251), E507K/D732R (SEQ ID NOS: 252-253), E507K/E742K (SEQ ID NOS: 254-255),
E507K/E537K/D578R (SEQ ID NOS: 256-257), E507K/D578R/D732R (SEQ ID NOS: 258-259), E507K/E520K/E537K (SEQ ID NOS: 260-261), E507K/E520K/D578R (SEQ ID NOS: 262-263), E507K/E520K/E742K (SEQ ID NOS: 264-265), E507K/E537K/E742K (SEQ ID NOS: 266-267), E507K/D732R/E742K (SEQ ID NOS: 268-269),
E520V (SEQ ID NOS: 282-283),
E520K/E537K (SEQ ID NOS: 284-285), E520K/E537K/E742K (SEQ ID NOS: 300-301),
E537A (SEQ ID NOS: 286-287), E537F (SEQ ID NOS: 288-289), E537I (SEQ ID NOS: 290-291), E537K (SEQ ID NOS:
292-293),
E537K/D732R (SEQ ID NOS: 294-295), E537K/E742K (SEQ ID NOS: 296-297),
E537K/D578R/D732R (SEQ ID NOS: 298-299), E537R (SEQ ID NOS: 302-303), E537Y (SEQ ID NOS: 304-305),
L541S (SEQ ID NOS: 306-307),
N565R (SEQ ID NOS: 308-309),
T569A (SEQ ID NOS: 310-311),
A57OF (SEQ ID NOS: 312-313),
S575I (SEQ ID NOS: 314-315),
S577I (SEQ ID NOS: 316-317),
D578F (SEQ ID NOS: 318-319), D578H (SEQ ID NOS: 320-321), D578R (SEQ ID NOS: 322-323), D578S (SEQ ID NOS: 8-9),
D578R/D732R (SEQ ID NOS: 324-325), D578R/E742K (SEQ ID NOS: 326-327),
D578V (SEQ ID NOS: 328-329),
1584S (SEQ ID NOS: 330-331),
N627R (SEQ ID NOS: 334-335),
V631S (SEQ ID NOS: 336-337),
H639E (SEQ ID NOS: 338-339),
W645A (SEQ ID NOS: 340-341),
A675F (SEQ ID NOS: 344-345),
S699I (SEQ ID NOS: 350-351),
D732A (SEQ ID NOS: 354-355), D732C (SEQ ID NOS: 10-11), D732H (SEQ ID NOS: 14-15), D732K (SEQ ID NOS: 356-357), D732M (SEQ ID NOS: 358-359), D732P (SEQ ID NOS: 18-19), D732Q (SEQ ID NOS: 20-21), D732S (SEQ ID NOS: 22-23), D732T (SEQ ID NOS: 24-25), D732V (SEQ ID NOS: 364-365), D732Y (SEQ ID NOS: 366-367),
D732R/E742K (SEQ ID NOS: 362-363),
E742D (SEQ ID NOS: 370-371), E742F (SEQ ID NOS: 372-373), E742I (SEQ ID NOS: 376-377), E742M (SEQ ID NOS: 380-381), E742N (SEQ ID NOS: 382-383), E742P (SEQ ID NOS: 384-385), E742T (SEQ ID NOS: 386-387), E742V (SEQ ID NOS: 388-389), E742Y (SEQ ID NOS: 390-391),
E745K (SEQ ID NOS: 392-393),
M751S (SEQ ID NOS: 394-395),
R801D (SEQ ID NOS: 396-397), and
E805K (SEQ ID NOS: 400-401).
2. The [ A ] mutant Taq polymerase of claim 1 which is one of the following even-numbered amino acid sequences [ but wherein the mutant Tag polymerase does not include the 6-membered histidine tag at its C-terminus and the six immediately preceding Glycine and Serine amino acids which are amino acid numbers 833 to 844 in each of the following even-numbered amino acid sequences] : G32P (SEQ ID NOS: 402-403); Q42R (SEQ ID NOS: 406-407); E101K (SEQ ID NOS: 46-47); V103S (SEQ ID NOS: 410-411); Y116A (SEQ ID NOS: 412-413); E117K (SEQ ID NOS: 48-49); E130K (SEQ ID NOS: 50-51); D144R (SEQ ID NOS: 6-7); E159K (SEQ ID NOS: 56-57); 1163S (SEQ ID NOS: 404-405); E189T (SEQ ID NOS: 112-113); E189W (SEQ ID NOS: 114-115); E201K (SEQ ID NOS: 116-117); E230C (SEQ ID NOS: 122-123); E230F (SEQ ID NOS: 124-125); E230H (SEQ ID NOS: 126-127); E230N (SEQ ID NOS: 164-165); E230P (SEQ ID NOS: 166-167); D320R (SEQ ID NOS: 184-185); L322S (SEQ ID NOS: 186-187); A323F (SEQ ID NOS: 188-189); R328D (SEQ ID NOS: 190-191); G330P (SEQ ID NOS: 192-193); R334D (SEQ ID NOS: 194-195); P336G (SEQ ID NOS: 196-197); E337K (SEQ ID NOS: 198-199); P338G (SEQ ID NOS: 200-201); Y339A (SEQ ID NOS: 202-203); T341 (SEQ ID NOS: 408-409); D344R (SEQ ID NOS: 204-205); E347K (SEQ ID NOS: 206-207); A348F (SEQ ID NOS: 208-209); R349D (SEQ ID NOS: 210-211); L351S (SEQ ID NOS: 212-213); L361S (SEQ ID NOS: 214-215); L365S (SEQ ID NOS: 216-217); G366P (SEQ ID NOS: 218-219); P368G (SEQ ID NOS: 220-221); M374S (SEQ ID NOS: 222-223); L380S (SEQ ID NOS: 224-225); D381R (SEQ ID NOS: 226-227); P382G (SEQ ID NOS: 228-229); S383I (SEQ ID NOS: 230-231); N384R (SEQ ID NOS: 232-233); A391F (SEQ ID NOS: 234-235); A407F (SEQ ID NOS: 240-241); A414F (SEQ ID NOS: 242-243); [E507Q (SEQ ID NOS: 270-271);] E507R (SEQ ID NOS: 272-273); E507T (SEQ ID NOS: 276-277); E520V (SEQ ID NOS: 282-283); E537A (SEQ ID NOS: 286-287); E537F (SEQ ID NOS: 288-289); E537I (SEQ ID NOS: 290-291); E537K (SEQ ID NOS: 292-293); E537R (SEQ ID NOS: 302-303); E537Y (SEQ ID NOS: 304-305); N565R (SEQ ID NOS: 308-309); A570F (SEQ ID NOS: 312-313); S575I (SEQ ID NOS: 314-315); S577I (SEQ ID NOS: 316-317); D578F (SEQ ID NOS: 318-319); D578R (SEQ ID NOS: 322-323).
16. A process of conducting PCR, comprising:
adding to a PCR mixture including a target sequence and target sequence primers, a mutant Taq polymerase having one or more of the following amino acid mutations at the positions in the even-numbered sequences, and wherein the remainder of the mutant polymerase has at least 80% [ 99.6% ] amino acid sequence identity with wild type Taq polymerase, as shown in SEQ ID NO: 4 but wherein wild type Taq polymerase does not include the 6-membered histidine tag at its C-terminus and the six immediately preceding Glycine and Serine amino acids shown in SEQ ID NO: 4:
G32P (SEQ ID NOS: 402-403),
T34I (SEQ ID NOS: 408-409),
E39K/E230K (SEQ ID NOS: 28-29), E39K/D320R (SEQ ID NOS: 30-31), E39K/E507K (SEQ ID NOS: 32-33), E39K/E520K (SEQ ID NOS: 34-35), E39K/E537K (SEQ ID NOS: 36-37), E39K/D578R (SEQ ID NOS: 38-39), E39K/D732R (SEQ ID NOS: 40-41), E39K/E742K (SEQ ID NOS: 42-43), E39K/E189K (SEQ ID NOS: 44-45),
Q42R (SEQ ID NOS: 406-407),
E101K (SEQ ID NOS: 46-47),
V103S (SEQ ID NOS: 410-411),
Y116A (SEQ ID NOS: 412-413),
E117K (SEQ ID NOS: 48-49),
E130K (SEQ ID NOS: 50-51),
D144R (SEQ ID NOS: 6-7),
E159K (SEQ ID NOS: 56-57),
I163S (SEQ ID NOS: 404-405),
E189C (SEQ ID NOS: 58-59), E189D (SEQ ID NOS: 60-61), E189K (SEQ ID NOS:
62-63),
E189K/E230K (SEQ ID NOS: 64-65), E189K/E507K (SEQ ID NOS: 66-67), E189K/E537K (SEQ ID NOS: 68-69), E189K/D578R (SEQ ID NOS: 70-71), E189K/D732R (SEQ ID NOS: 72-73), E189K/E742K (SEQ ID NOS: 74-75),
E189K/E230K/E537K (SEQ ID) NOS: 76-77), E189K/E507K/E537K (SEQ ID NOS: 78-79), E189K/E520K/ E537K (SEQ ID NOS: 80-81), E189K/E230K/E520K (SEQ ID NOS: 84-85), E189K/E230K/D578R (SEQ ID NOS: 86-87), E189K/E507K/D578R (SEQ ID NOS: 88-89), E189K/E230K/D732R (SEQ ID NOS: 90-91), E189K/E537K/D732R (SEQ ID NOS: 92-93), E189K/E507K/E520K (SEQ ID NOS: 94-95), B189K/E537K/D578R (SEQ ID NOS: 96-97), E189K/ B537K/E742K (SEQ ID NOS: 98-99), E189K/D732R/E742K (SEQ ID NOS: 100-101),
E189L (SEQ ID NOS: 102-103), E189M (SEQ ID NOS: 104-105), E189P (SEQ ID NOS: 106-107), E189Q (SEQ ID NOS: 108-109), E189R (SEQ ID NOS: 110-111), E189T (SEQ ID NOS: 112-113), E189W (SEQ ID NOS: 114-115),
E201K (SEQ ID NOS: 116-117),
E230C (SEQ ID NOS: 122-123), E230F (SEQ ID NOS; 124-125), E230H (SEQ ID NOS: 126-127), E230K (SEQ ID NOS: 128-129),
E230K/E520K (SEQ ID NOS: 132-133), E230K/E537K (SEQ ID NOS: 134-135), E230K/D578R (SEQ ID NOS: 136-137), E230K/D732R (SEQ ID NOS: 138-139), E230K/E742K (SEQ ID NOS: 140-141),
E230K/E507K/E520K (SEQ ID NOS: 142-143), E230K/E507K/E537K (SEQ ID NOS: 144-145), E230K/E520K/D578R (SEQ ID NOS: 146-147), E230K/B537K/D578R (SEQ ID NOS: 148-149), E230K/E537K/D732R (SEQ ID NOS: 150-151), E230K/E507K/E742K (SEQ ID NOS: 152-153), E230K/E520K/E742K (SEQ ID NOS: 154-155), E230K/E537K/E742K (SEQ ID NOS: 156-157), E230K/D578R/E742K (SEQ ID NOS: 158-159), E230K/D732R/E742K (SEQ ID NOS: 160-161),
E230M (SEQ ID NOS: 162-163), E230N (SEQ ID NOS: 164-165), E230P (SEQ ID NOS: 166- 167), E230Q (SEQ ID NOS: 168-169), E230R (SEQ ID NOS: 170-171), E230S (SEQ ID NOS: 172-173), E230T (SEQ ID NOS: 174-175), E230V (SEQ ID NOS: 176-177), E230W (SEQ ID NOS: 178-179), E230Y (SEQ ID NOS: 180-181),
D320R (SEQ ID NOS: 184-185),
L322S (SEQ ID NOS: 186-187),
A323F (SEQ ID NOS: 188-189),
R328D (SEQ ID NOS: 190-191),
G330P (SEQ ID NOS: 192-193),
R334D (SEQ ID NOS: 194-195),
P336G (SEQ ID NOS: 196-197),
E337K (SEQ ID NOS: 198-199),
P338G (SEQ ID NOS: 200-201),
Y339A (SEQ ID NOS: 202-203),
D344R (SEQ ID NOS: 204-205),
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and
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amplifying the target sequence by temperature cycling to cause annealing of the primers to the target sequence and wherein conditions for extension of the primers are limited to one second or less, followed by deannealing of the extended primers.